癫痛是常见的神经系统疾病,最显著的临床特征是长期反复出现的癫病发作,伴随不同的临床和脑电图的表现。迄今为止,研究癫病发病机理仍需依赖动物模型。判断癫痛动物模型是否符合人类癫痛特征的标准主要包括:动物模型的生物电发放和发作行为需与人类癫痛一致,如若无发作症状,脑电图须显示有生物电异常发放,称为癫病样放电。
一丶急性癫痫动物模型
【概述】急性癫痫模型常为单次处理即可诱发癫痫的一次急性发作模型。包括最大电休克(maximal electroshock, MES)癫痫模型和戊四唑(pentylenetetrazol, PTZ)癫痫模型。
(一)最大电休克癫痫模型(MES)
【造模机制】在动物两耳或眼球部位放置电极,以强电流通过电极对脑部进行短时间刺激,使动物产生双后肢强直性惊厥。
【造模方法】用电休克仪或药理生理实验多用仪,导线引出交流电,将输出线上连接鳄鱼夹,以生理盐水湿润后,分别夹于小鼠或大鼠双耳,或用稍凹圆盘状角膜电极接触双角膜(角膜用丁卡因麻醉),随即通电,即可使小鼠或大鼠发生典型的前肢屈曲、后肢伸直的强直性惊厥。惊厥过程可分为潜伏期、强直期、阵挛期及惊厥后抑制期。
观察指标:以动物是否出现后肢强直为观察指标,若某种药物能阻止其发生,说明该药具有抗MES作用。
【模型特点】MES模型是使用较多、研究较为透彻的模型之一。常用于模拟人类的强直阵挛癫痫大发作,并用于抗强直-阵挛癫痫大发作的药物筛选。经典的抗癫痫药物苯妥英钠就是通过MES模型发现的。
【模型评估和应用】MES癫痫模型制备方法简单,且有比较高的筛选抗癫痫药物的效率。但急性癫痫模型也有其不足之处:MES模型对作用于离子型通道的药物作用效果显著,可能忽略了其他有抗癫痫作用的药物(如氨基己酸、噻加宾等); MES癫痫模型不适合抗部分癫痫发作的药物的筛选,如MES模型提示N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)的拮抗剂有效,但是该拮抗剂在点燃(kindling)模型及临床试验中都没有明确的抗癫痫作用。需要强调的是,急性癫痫模型不能模仿人类癫痫发生发展的整个过程,更不能模拟难治性癫痫、药物抵抗性癫痫的病理生理改变过程。
(二)戊四氮癫痫模型(PTZ)
【造模机制】PTZ是四唑衍生物,全身给药时,在小鼠、大鼠、猫及灵长类动物中具有恒定的惊厥作用。
【造模方法】PTZ主要作用于脑干及前脑,使兴奋性突触的易化过程增强而引起惊厥发作。方法:18～25g小鼠,实验前自由饮食,实验时禁食,由尾静脉迅速注入PTZ生理盐水溶液,可使97%的小鼠产生强直发作。
观察指标:以后肢强直为观察指标,药物能阻止其出现则有效。
【模型特点】PTZ模型能够模拟人类的肌阵挛癫痫全身发作,临床上使用的乙琥胺就是通过此模型发现。
【模型评估和应用】PTZ癫痫模型制备方法简单,且有比较高的筛选抗癫痫化合物的效率,在过去的几十年里MES模型和PTZ模型是作为初次筛选癫痫药物的金标准。PTZ模型作为筛选非痉挛癫痫发作的癫痫动物经典模型,也有其不足之处:未能发现拉莫三嗪的抗非痉挛癫痫发作的作用;而替加宾和氨基己酸在PTZ模型中表现为明显的抗非痉挛癫痫的效果,却在临床上表现为加重非痉挛癫痫发作的病情。
(三)青霉素致癫痫动物模型
【造模材料】动物:SD大鼠,雌雄各半,体重(300±20)g;药物:青霉素。
【造模方法】模型组腹腔注射高剂量青霉素,空白组同时腹腔注射等量生理盐水。
【造模原理】青霉素能引起癫痫发作的可能机制为其可抑制GABA能神经元,引起抑制性突触活动减弱或兴奋性突触活动增强,从而导致神经元兴奋性增高。当神经元兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential, EPSP)综合超过一定阈值即可产生阵发性去极化飘移(paroxysmal depolarization shift, PDS),这一过程与Ca2密切相关。PDS是癫痫电生理学的主要特征之一,脑电图记录到的棘波就是PDS有关动作电位的反应。
【造模后的体征】造模前大鼠活动灵活,饮食正常,反应敏捷,皮毛纯白光滑。腹腔注射高剂量青霉素后,动物逐渐变得安静,随后出现眼神呆滞、呼吸加快,继而出现点头、头部肌群抖动,或身体突然出现一下抽动。过20～30min后,轻者出现单个或多个肢体抽动,四肢分开,重心下降,翘尾,不协调地爬行;重者则表现为全身肌肉强烈抽动,突然奔跑,跳跃,摔倒,全身强直持续抽搐而至死亡。模型组癫痫性发作潜伏期为(50.81±11.43)s。
二丶慢性癫痫动物模型
【概述】慢性癫痫模型能够反映癫痫发作的起始、发展以及伴随的脑部病理生理的改变。这为更加深入研究癫痫提供了基础。根据给予刺激的强度和诱发的病情程度的不同,可分为点燃模型、持续性癫痫模型和自发性癫痫模型。
(一)点燃模型
【造模机制】点燃模型是指重复初始的亚惊厥剂量的刺激(电/化学药物刺激)丘脑和海马等部位,逐渐降低惊厥发作阈值并提高敏感性,经历一个从部分性发作(1～3级)到全身发作(4～5级)的慢性过程,最终表现为反复、自发发作。
【造模方法和模型特点】
1.电刺激点燃模型
该模型是研究癫痫发生机制使用最多的复杂部分性发作模型。能否出现点燃取决于刺激持续时间、强度、刺激间隔时间等参数。选取连续10次达到5级发作的大鼠用于筛选抗痫药及机制研究。点燃过程可分为6个阶段:①同侧面部抽搐;②两侧面部抽搐;③点头;④对侧前肢出现阵挛;⑤站立伴阵挛性跳跃;⑥摔倒伴全身强直一阵挛发作。电刺激脑部许多部位可引起点燃,最易点燃部位为杏仁核,其次为新皮质区和海马。
2.化学点燃模型-马桑内酯点燃模型
马桑内酯(coriaria lactone)多次造模给药后,动物出现凝视、呼吸急促、外耳静脉扩张,之后发展为运动不协调、面部抽搐、触须抖动、前肢抽动(发作级别为1～3级),伴有棘波和多棘波。完全点燃大鼠表现为站立伴双上肢抽动(4级)和失去姿势平衡、摔倒(5级),最终表现为全身强直-阵挛发作,持续10～20秒,脑电图(EEG)表现为高波幅痫性放电。该模型病理改变主要为海马区星形胶质细胞明显变性、坏死,提示马桑内酯对星形胶质细胞和大脑皮质细胞有损伤性作用,该损伤可能在诱导癫痫发作中起一定作用。该模型建立简便,点燃效率高,死亡率低,适于推广。
【模型评估和应用】点燃模型行为规范,可控性和重复性好,易于判断与定量研究。为研究人类癫痫发生机制、药物有效性及抗癫痫药物耐药的分子机制,寻找新的或更有效的治疗药物,提供了一个理想的动物模型。此模型较好地模拟了人类癫痫发生、扩布和形成的全过程,被认为是更为接近人类癫痫的慢性模型。点燃模型被广泛用于寻找治疗部分性发作的新药,在点燃过程中预先给予所测试的药物,观察该药物能否阻止或延缓点燃现象的发生,以检测该药是否具有抗惊厥作用和(或)抗癫痫灶形成的作用。
(二)持续性癫痫模型和自发性癫痫模型
1.Lithium-Pilocarpine模型
【造模机制】Lithium(锂)-Pilocarpine(匹罗卡品)模型是目前应用最多的癫痫持续状态模型及自发发作模型。Pilocarpine为胆碱能肌肉激动剂,全身给药可引起癫痫发作。氯化锂用来提高机体对 pilocarpine敏感性。
【造模方法和模型特点】Lithium 腹腔注射18～24小时后,pilocarpine 腹腔注射。给pilocarpine前30分钟,腹腔注射东莨菪碱,以减轻外周症状。其发生发展过程可分为急性期、静止期、慢性期。急性期:表现为癫痫持续状态,持续24小时。惊厥行为反应级别采用 Racine分级标准。静止期:发作完全停止,恢复正常进食与活动,体重回升,部分易激惹,有攻击行为;EEG正常;持续4～44天。慢性期:出现反复自发性的癫痫发作,相当于点燃模型的4～5级,持续数秒至数十秒,2～3次/周。Lithium-Pilocarpine模型与年龄具有高度相关性,在成年鼠诱导后,100%可出现自发性的癫痫发作,潜伏期为(15±3)天,神经元损害主要位于海马、丘脑、梨状核、新皮层;在18～24天龄大鼠诱导后,22%可出现自发性的癫痫发作,潜伏期为(37±25)天,神经病理改变与成年鼠相同,在7～11天大鼠诱导后,无自发性的癫痫发作,无神经损害。
【模型评估和应用】参见海人酸模型。
2.海人酸模型
【造模机制】海人酸(kainic acid, KA)结构类似谷氨酸,能产生很强的神经兴奋作用。KA与突触后膜的海人酸受体结合,产生兴奋性突触后电位,引起癫痫发作。
【造模方法和模型特点】全身给药(静脉或腹腔注射),KA;或局部给药(脑室内、单侧或双侧海马、杏仁核、梨状核、纹状体等)。根据症状表现可分为急性期(注射后4～7天)、静止期(急性期后4～7天)、慢性期。急性期(癫痫持续状态):注射KA几分钟后,出现须动、面部肌肉抽动、尾巴翘起,之后为凝视、点头、咀嚼、双上肢抖动,最终发展为向对侧翻滚、全身强直,持续3～5小时。静止期:发作完全停止,恢复正常进食与活动,体重回升,部分大鼠易激惹,有攻击行为。慢性期(自发发作):自发性反复的癫痫发作是这一时期的主要特点。发作类似于杏仁核点燃发作,持续40～60秒,表现为流涎、咀嚼、双上肢阵挛性抽动、湿狗样抖动、战立、失去姿势平衡而摔倒。
【模型评估和应用】Lithium-Pilocarpine模型和KA模型发生发展过程与人类颞叶癫痫高度相似,具有相似的病理学基础(神经元丢失、胶质细胞增生、苔藓纤维丝状芽生等),对大部分抗癫痫药物耐药,被广泛应用于抗癫痫药物耐药机制及癫痫发生的分子机制研究中。
