版本:202508V2
*本文中YuanStem 20,简写成YS20。
准备工作
配置YS 20完全培养基
1.1 将YS20 10x Supplement提前一天取出置于2℃-8℃条件下解冻。
1.2 用无菌移液管将50ml 10x Supplement与450mlYS20 Basal Medium混合均匀,成为YS20完全培养基(以下简称YS20完全培养基)。
*YS20完全培养基可在2℃-8℃避光条件下保存1月,使用前预热至室温。
使用Matrigel或VTN包被孔板
1.3a Matrigel包被孔板:按照使用品牌的说明书操作进行孔板包被,以0.1ml/cm2的用量(1ml/六孔板1孔)将Matrigel稀释液加入TC处理的培养容器中,晃动容器使其覆盖全部表面,37℃培养箱中包被一小时以上。
*包被好的孔板可以封口后在2-8℃保存,2周内使用。
1.3b VTN包被孔板:按照使用品牌的说明书操作进行孔板包被,推荐使用10ug/ml浓度进行包被,培养箱(37℃)静置至少2小时后使用。
使用YS20培养基复苏细胞
YS20复苏/传代培养基配制:室温预热YS20完全培养基,根据所用凋亡抑制剂(如Y27632等)推荐浓度加入适当体积的凋亡抑制剂,配置YS20复苏/传代培养基。
*Y27632推荐浓度为5-10uM。
吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN,每孔加入2ml YS20复苏/传代培养基,放入37℃培养箱中平衡pH和温度。
将细胞从液氮罐中取出,置于干冰上,转移至细胞房内。手持冻存管置于37℃水浴锅或细胞复苏仪中解冻,冻存管内仅剩小片冰晶时,用70%酒精表面消毒。
将冻存管内的细胞转移至含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中,轻轻吹打,200 g 离心 3 分钟,吸弃上清,用1-2ml YS20复苏/传代培养基重悬。
*使用DMEM/F12或YS20完全培养基润洗冻存管内侧以尽可能多地收集细胞。
以合适的密度将重悬后的细胞接种至步骤2.2准备的六孔板中,在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀,24h后更换为YS20完全培养基。
*复苏时通常以50万细胞/孔或更高密度接种,正常情况下6小时内绝大部分细胞都可以完成贴壁。
以单细胞形态进行传代和冻存
* 当细胞融合度达到80-90%时,可以进行传代。
室温预热YS20完全培养基、PBS(不含钙、镁,下同)、TrypLE Express消化液和Matrigel/VTN包被的六孔板,并配置YS20复苏/传代培养基(步骤2.1)。
吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN,每孔加入2ml YS20复苏/传代培养基,放入37℃培养箱中平衡pH和温度。
从培养箱中取出细胞,吸弃培液。每孔加入1ml PBS,轻柔晃动孔板以润洗表面一次,吸弃。每孔加入1ml TrypLE Express,置于37℃培养箱中消化3-5分钟。
* 观察到细胞有明显脱壁迹象(细胞团边缘明显变亮,但其主体部分仍未脱壁)时即可进行下一步操作。
每孔加入1ml YS20完全培养基,用移液器轻柔吹打3-4次,将所有细胞悬液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中,200 g 离心 3 分钟,吸弃上清,用1-2ml YS20复苏/传代培养基重悬后计数
以合适的密度将重悬后的细胞接种至步骤3.2准备的六孔板中,在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀,24h后更换为YS20完全培养基。
*传代扩增每个孔接种密度为10-30万细胞,其他分化实验根据需求密度接种;接种后剩余的细胞如果需要保留,可以离心去上清后以2×106/ml的密度冻存。
以细胞团形态进行传代和冻存
* 将PSC消化成细胞团形态进行传代和冻存对细胞造成的压力较小,适合不需要精确控制细胞接种数量的场景,如日常留种传代。
室温预热YS20完全培养基、PBS、0.5mM EDTA和Matrigel/VTN包被的六孔板
吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN,每孔加入2ml YS20完全培养基,放入37℃培养箱中平衡pH和温度。
从培养箱中取出细胞,吸弃培液。每孔加入1ml PBS,轻柔晃动孔板以润洗表面一次,吸弃。每孔加入1ml 0.5mM EDTA消化液,置于37℃培养箱中消化5-8分钟。
*显微镜下观察,细胞团边缘明显变亮、有脱壁迹象时即可终止消化。
用移液器轻柔吹打3-4次使细胞团从六孔板表面脱落,并形成较为均匀的细胞悬液,将所有细胞悬液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中,200 g 离心 3 分钟,吸弃上清,用1-2ml YS20完全培养基重悬。
*如果细胞的贴壁力度较强,也可使用细胞刮刀辅助传代。
根据后续实验计划,在步骤4.2准备的六孔板中以1:5-1:20的比例接种细胞团,在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀,24h后更换新的YS20完全培养基。
* 接种后剩余的细胞如需保留,可以离心去上清后以估算的100万/管的密度冻存。
YS20多能干细胞培养基的传代/换液方案
YuanStem 20多能干细胞培养基产品如下——
货号 | 规格 | 储存条件 | 保质期 | |
YuanStem 20基础培养基 | 88-020500A | 450 ml | 2-8℃,避光保存 | 18个月 |
YuanStem 20添加剂(10x) | 88-020500B | 50 ml | -15℃ - -30℃,避光保存 | 36个月 |
